Progetto molecolare di un nuovo antiossidante
per la soppressione del fotoinvecchiamento

Manabu Kitazawa, Keilj Iwasaki, Yukiko Ishitsuka, Kumi Arakane

*Ajinooto Co., Inc. AminoScience Laboratories Suzuki-cho 1-1 Kawasaki-ku, Kawasaki 210-8581, Giappone
**Kosé Corporation, Fundamental Research Laboratories Azusawa 1-18-4, Itabashi-ku, Tokyo 174-0051, Giappone

Estratto
Abbiamo progettato un nuovo antiossidante con capacità sequestrante del ferro per sopprimere il fotoinvecchiamento della pelle causato dai raggi ultravioletti. Il principio del progetto molecolare è di imitare le strutture e le funzioni delle proteine sequestranti del ferro, quali la siderofillina, coniugando una vitamina con un amminoacido. Pertanto, è stata preparata la N-(4-piridossilmetilene)-L-serina-(PYSer), una molecola coniugata stabilizzata di piridossina (vitamina B6 aldeidiforme) e L-serina. Il PYSer ha formato un complesso 2:1 con ioni di ferro (Fe*(PYSer)2), La capacità antiossidante del PYSer, mediato sopprimendo la generazione di radicali di idrossile causati dal ferro, è stata scoperta mediante prova di propagazione guidata a spinta centrifuga dell'ESR e dell'idrossilazione del salicilato. Il potenziale redox di PYSer-Fe3+/PYSer-Fe2+ ha dimostrato la stabilizzazione superiore della specie catalitica attiva Fe3+, piuttosto che della specie Fe2+, per la generazione dei radicali dell'idrossile. Nello studio sul fotoinvecchiamento di cavie glabre, il PYSer ha soppresso la formazione di rughe causata da UVB e l'ipertrofia dermica. Tali risultati indicano che la coniugazione della vitamina B6 con l'amminoacido rappresenta un approccio promettente per il progetto molecolare di antiossidanti con capacità sequestrante del ferro.

Introduzione
La luce solare ultravioletta (UV) contribuisce al fotodanneggiamento della pelle, ad esempio tumori della pelle, fotoinvecchiamento, fotosensibilizzazione ed altre patologie della pelle causate dalla luce [1,2]. È risaputo che le specie di ossigeno reattivo (ROS) contribuiscono in notevole misura al fotodanneggiamento causato da UV. Il ferro cutaneo catalizza la produzione di ROS, soprattutto i radicali dell'idrossile, mediante la reazione di Haber-Weiss (Fig.1) [3,4]. Negli organismi viventi, il ferro viene trasportato e immagazzinato dalle proteine leganti del ferro quali la siderofillina e la ferritina. Tuttavia, ferro libero viene emesso all'interno delle cellule sotto sollecitazione ossidante. La radiazione UVA causa l'emissione del ferro nei fibroblasti primari della pelle umana [5]. La produzione accentuata di metalloproteasi e la perossidazione lipidica nei fibroblasti dermici irradiati con UVB vengono soppresse dalla disferriossamina (DFO), un potente agente chelante del ferro [6]. Tali risultati indicano che il ferro contribuisce alla sollecitazione ossidante causata sia da UVA sia da UVB. Pertanto, è importante modellare antiossidanti con capacità sequestrante del ferro. Diversi ricercatori sono impegnati nello studio di agenti chelanti del ferro per la riduzione della sollecitazione ossidante causata da UV. Bissett e colleghi sono pionieri in questo campo. Essi hanno scoperto che la radiazione UV aumentava il contenuto di ferro cutaneo e un agente chelante del ferro, la dipiridilamina, sopprimeva la formazione di rughe causate da UV nelle cavie glabre [7]. Abbiamo notato che coniugati di amminoacidi e aldeide salicilica hanno una somiglianza strutturale con le proteine sequestranti del ferro, quali la siderofillina [8]. Abbiamo dimostrato che coniugati di amminoacidi con aldeide naftilica o aldeide salicilica sopprimevano la generazione di radicali di idrossile provocati dal ferro e riduceva la sollecitazione ossidante causata da UV sequestrando il ferro attivo cataliticamente [9,10]. Recentemente si è parlato di protezione cellulare da lesioni ossidanti mediante una nuova serie di agenti chelanti del ferro [11].

Fig. Sollecitazione Ossidante
Fig. 1 - Meccanismo generalizzato per la reazione di Haber-Weiss sul ferro catalizzato e la perossidazione lipidica (L-H) in cellule e tessuti, come indicato nel rif. [4].

Per creare un antiossidante cosmetico ideale che sia non solo funzionale ma che presenti anche un'utilità cosmetica, abbiamo applicato il progetto molecolare per coniugare una vitamina con un amminoacido. Abbiamo notato che la deficienza di vitamina B6 causa dermatite seborroica e che la vitamina B6 e i suoi derivati sono usati come ingredienti cosmetici per curare la pelle ruvida. La vitamina B6 è un coenzima correlato al metabolismo degli amminoacidi e si conoscono forme coniugate di fosfato-5-di piridossina (una forma di vitamina B6) e di amminoacidi che si manifestano in natura. Queste molecole hanno una somiglianza strutturale con l'agente chelante amminoacido del ferro che abbiamo progettato. Come intermediari metabolici, le forme coniugate non sono chimicamente stabili in formulazioni cosmetiche a causa della propria struttura di base Shiff. Abbiamo applicato l'idrogenazione della base Shiff per creare un coniugato stabile di vitamina B6 e un amminoacido. Pertanto, abbiamo preparato la N-(4-piridossilmetilene)-L-serina-(PYSer), una molecola coniugata stabilizzata di piridossina (vitamina B6 aldeidiforme) e L-serina. In questa sede dimostriamo le capacità antiossidanti e anti-fotoinvecchiamento di questa nuova molecola.

Discussione
Il PYSer sopprimeva la generazione di radicali d'idrossile provocata dal ferro e la formazione di rughe causate da UV. Poiché il composto forma complessi stabili con Fe3+ e inibisce la generazione di radicali d'idrossile provocata dal ferro, si prevede che esso sopprima le reazioni di radicali liberi sequestrando il ferro catalitico nel corpo.
Abbiamo confermato la formazione di 2:1 complessi di PYSer rispetto a Fe3+. Il composto ha tre possibili punti di legame a Fe3+: il gruppo d'idrossile nella posizione-3 dell'anello aromatico e il carbossilato e gli ammino-gruppi nel residuo di amminoacido.
Pertanto, si prevede che tutti e sei i punti di legame a Fe3+ verrebbero occupati con due molecole leganti. Pertanto, il complesso ferroso non catalizza più la reazione di Haber-Weiss a causa dell'assenza del sito catalitico. Quindi, il PYSer, a doppia quantità molare di ione ferroso, ha inibito la generazione dei radicali. L'inibizione insufficiente in presenza di PYSer a meno del doppio della quantità molare dello ione ferroso è dovuta all'occupazione incompleta del punto di legame del ferro.
Nella nostra analisi del complesso PYSer-Fe3+, abbiamo stimato che i valori logK fossero da 21 a 22. Tali valori sono superiori a quelli delle proteine del ferro (logK = 16-18) [16] ma sono di gran lunga inferiori a quello dell'EDTA (logK = 25) [14]. La moderata affinità del composto PYSer per gli ioni ferrosi dovrebbe evitare gli effetti collaterali indesiderabili. Si ritiene che queste idonee proprietà del PYSer come antiossidante derivino dalla somiglianza del suo meccanismo legante del ferro rispetto a quello delle proteine del ferro. In uno studio preliminare del potenziale redox di PYSer-Fe3+/PYSer-Fe2+, abbiamo stimato che il valore sia di -34mV rispetto a NHE. Tale basso potenziale di PYSer-Fe3+/PYSer-Fe2+, rispetto a quello di EDTA-FE3+/EDTA-FE2+ (+120 MV rispetto NHE) [15] favorisce l'ossidazione di Fe a Fe3+, che è meno reattiva con H2O2 nella reazione di Haber-Weiss. Si ritiene che il meccanismo antiossidante del PYSer costituisca la stabilizzazione di Fe3+, cui Fe è rapidamente convertito mediante auto-ossidazione [17].
In cavie glabre irradiate con UVB, quale modello di fotoinvecchiamento umano [18, 19], il PYSer ritardava la formazione di rughe. Bissett e colleghi hanno dimostrato che un agente chelante del ferro ritardava la formazione di rughe e sopprimeva l'aumento del contenuto di ferro cutaneo nelle cavie esposte a UVB [7]. Crediamo che il meccanismo della fotoprotezione mediante PYSer avvenga anche tramite la chelazione dello ione ferroso, che contribuisce alla soppressione della generazione catalitica delle ROS. È stato documentato che lo spessore dermico nonché lo spessore epidermico aumentavano con il tempo di esposizione a UVB nel modello di fotoinvecchiamento [20]. Il trattamento PYSer sopprimeva in misura notevole l'aumento dello spessore dermico rispetto al trattamento mediante veicolo. È risaputo che l'esposizione cronica di pelle murina a radiazione UVB determinava alterazioni delle componenti matrice extracellulari del derma, quali collagene, elastina e glicosamminoglicani (GAG), oltre alla formazione di rughe sulla superficie della pelle [19, 21, 22]. La soppressione mediante PYSer dell'ipertrofia dermica provocata da UVB potrebbe essere correlata alla protezione da danneggiamento dermico. Anche se l'EDTA è un agente chelante del ferro comunemente usato, è assai efficace ai fini della protezione dalla formazione di rughe causata da UVB e dall'aumento dello spessore della pelle. L'EDTA favoriva la formazione di radicali d'idrossile nella prova dell'idrossilazione del salicilato. Questa azione favorevole sarebbe dovuta all'occupazione insufficiente del sito di legame del ferro [23]. Inoltre, il complesso EDTA-ferro è più reattivo con H2O2 nella reazione di Haber-Weiss, a causa del suo alto potenziale redox rispetto a quello del complesso PYSer-ferro, come descritto in precedenza. Pertanto, l'inefficacia dell'EDTA ai fini della protezione contro il fotodanneggiamento potrebbe essere dovuto all'assenza di un effetto soppressivo della formazione delle ROS causata dal ferro.
In sintesi, il PYSer dimostrava un effetto protettivo contro il fotoinvecchiamento nelle cavie glabre. Sembra che il meccanismo di fotoprotezione avvenga mediante la soppressione della generazione di radicali d'idrossile, come dimostrato in una prova in vitro. Recentemente, abbiamo scoperto ulteriori effetti preventivi del PYSer contro il fotoinvecchiamento in relazione alle ROS. Precisamente, il PYSer riduceva la generazione di ossigeno in una reazione fotosensibile e la melanogenesi nelle cellule del melanoma [24]. Il PYSer è preparato mediante la coniugazione di due composti naturali: L-serina e vitamina B6, che sono rispettivamente un amminoacido idratante naturale e un coenzima essenziale. La forma coniugata è analoga a quella rinvenuta nel metabolismo degli amminoacidi. D'altro canto, le molecole documentate per la prevenzione della generazione dei radicali dell'idrossile sono tutti agenti chelanti sintetici, per cui sicurezza ed effetti avversi sono fattori di grande attenzione. Ne risulta che il PYSer è un nuovo e promettente antiossidante per applicazioni cosmetiche mirate alla prevenzione del fotoinvecchiamento cronico.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Prof. Lester Packer dell'Università della California a Berkeley e il Prof. Barry Halliwell dell'Università Nazionale di Singapore, per le utili discussioni in merito al nostro studio.